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VigeneCre-loxP重组系统腺相关病毒产品说明

发布时间:2017-07-17 10:47 |  点击次数:

一.Cre-loxP重组系统作用原理

     1、Cre重组酶和loxP位点

  1. 重组酶(Cyclization Recombination Enzyme)由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码,是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。它不仅具有催化活性,而且与限制酶相似,能够特异性识别loxP位点。
  2. (locus of X-overP1)位点长为34bp,包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。其中,反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点,而间隔区域决定了loxP位点的方向。
  3.  



图1. Cre重组酶和loxP位点
(http://2012.igem.org/Team:Tsinghua-A/Project/Design)

 
  1. Cre-loxP重组系统诱导基因重组的方式
  2.  
Cre-loxP系统存在几种诱导重组的方式,这是基于Cre重组酶与loxP位点的相互作用而实现的。
当基因组内存在loxP位点时,一旦有Cre重组酶,便会结合到loxP位点两端的反向重复序列区形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合,进而形成四聚体。随后,loxP位点之间的DNA被Cre重组酶切下,切口在DNA连接酶的作用下重新连接。重组的结果取决于loxP位点的位置和方向。主要存在几下几种重组方式:
  1. 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同,Cre重组酶敲除loxP间的序列;
  2. 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反,Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转;
  3. 两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上,Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位;
  4. 四个loxP位点分别位于两条DNA链或染色体上,Cre重组酶诱导loxP间的序列互换。



图2. Cre-loxP诱导基因重组的方式
(https://www.tumblr.com/search/rolling%20circle%20replication)
 
二.ViGeneCre-loxP重组系统的AAV载体构建和病毒包装服务
VigeneCre-loxP重组系统AAV载体
VigeneCre-loxP重组系统腺相关病毒 Cre重组酶诱导表达的FLEX-ON系统
Cre重组酶反式剪接系统
 
  1. 依赖Cre重组酶诱导表达的FLEX-ON系统
  2.  
结合组织特异性的启动子和不同的AAV血清型,FLEX-ON系统能完成更精准的组织特异性控制和时间控制。
在FLEX-ON系统中,目的基因反方向位于启动子下方,两侧分别连接两个“头对头”的loxPCre重组酶不存在时,目的基因不能表达;当Cre重组酶存在时,可以诱导目的基因的翻转,从而表达。



图3. Vigene提供依赖Cre的FLEX-ON系统示意图



图4. Vigene的FLEX-ON实验图

 
  1. 依赖Cre重组酶反式剪接系统——轻松拥有“表达大基因的AAV
  2. 5kb)使得AAV应用受到限制。ViGene为您提供依赖Cre的反式剪接系统,让您轻松拥有“表达大基因的AAV”。
  3. AAV的共转染效率高达90%ViGene将较大基因分为两部分构建于两个AAV载体上。通过ITR的重组、mRNA剪接和Cre-loxP消除ITR的对转录的抑制作用,实现目的蛋白的表达。相比于单个载体ViGene提供的依赖Cre的反式剪接系统的表达效率约20%
 


图5. ViGene提供依赖Cre的反式剪接系统示意图



图6. ViGene的依赖Cre的反式剪接系统实验图

 
三.VigeneCre-loxP重组系统AAV操作方法

(一)体外实验

以2型AAV病毒为例,Vigene为您推荐的MOI值104-105,是根HEK293细胞得出的数据,不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同。建议您感染目的细胞前,进行预实验摸索最佳MOI值,推荐使用有荧光的对照病毒来摸索条件。
1. 为了节省病毒,推荐使用96孔板进行预实验。
2. 将目的细胞接种于96孔板中,细胞融合率为50%为最佳。为保证细胞生长良好,请保证细胞贴壁过夜。
3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培养基中做1:10稀释(10-1),以此为起点做梯度稀释直至稀释10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。
 
4. 取出提前准备好的96孔板,先确定细胞生长状况是否良好。用准备好的病毒稀释液替代旧培养基,注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。
 
5. 在加入病毒稀释液后,请在12-24h后观察细胞状态来确认加入的病毒量是否合适,是否因为加入的病毒量影响细胞状态。如果细胞没有变化,即所加病毒对细胞没有毒性,可以继续培养。
 
6. AAV病毒对细胞的感染较慢,请在感染细胞后每天观察细胞中荧光表达情况。
 
另:如果您选择的产品没有荧光标签请在96小时以后的不同时间段分别收获细胞并通过Western-Blot或其他检测手段来检测基因表达。
注:由于AAV组织特异性,体外感染细胞的效率比较低,所以我们强烈推荐您购买AAV用于动物实验

(二)体内实验

针对小鼠/大鼠来说,研究不同的方向有不同的AAV注射方法,详情可查阅Vigene官网。
 
 
 
四.常见问题解答

1.重组AAV 安全吗?
迄今为止,未发现野生型AAV有致病性。野生型AAV,在无需辅助病毒(如腺病毒)的存在下,复制效率非常低。重组腺相关病毒(rAAV)由多个质粒(cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒)组成。Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列,因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。

2.哪些血清型的 AAV 可供选择?我该选用哪种AAV?
目前为您提供的AAV 血清型为AAV1,AAV2,AAV5,AAV7,AAV6,AAV8 &  AAV9。请参阅下面指南中参考文献的建议。


请同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表,以确定哪种血清型AAV更适合您的细胞。

3.使用重组腺相关病毒rAAV传递基因的优势是什么?
rAAV病毒滴度很高,可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性极小、体内表达外源基因时间长。

4.AAV 载体稳定吗? 如何保存AAV载体
纯化的AAV载体在4℃或更低温度下高度稳定。建议您将AAV分装后,-80℃下长期保存。

5.订制AAV服务,客户需要提供哪些材料? &客户收到的产品是怎样的?
您可以从我们的人源全长cDNA库(17,000预制ORF)中挑选,或者提供您的质粒DNA或DNA序列,我们将基因克隆至AAV载体。您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型。
基因沉默服务,请您提供确切的shRNA的序列以构建重组rAAV载体。我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记。
通常情况下,可为客户提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /mL。也可根据客户的需要,提供特定体积和滴度的产品。
 
更多详情请点击www.vigenebio.cn官网查看