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腺病毒的包装,纯化和感染

发布时间:2017-07-19 11:48 |  点击次数:

一、技术背景:

Adeasy 系统利用了腺病毒具有的高感染能力,可高度浓缩等优点,并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1,使之成为较为安全、高效的病毒载体。利用带有E1 基因的293 细胞作为包装细胞,通过倍比扩增,富集病毒颗粒,并通过CsCl 梯度离心,透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100%的感染效率。但需要指出的是Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。

二、所需试剂:

      1. 293 细胞;
      2. 重组好的腺病毒质粒;
      3. Pac I 限制性内切酶;
      4. 质粒回收相关试剂;
      5. 细胞培养、转染相关试剂;
      6. TBS:10mM Tris, 0.9% NaCl,pH8.1;
      7. 40% CsCl:28.45 g CsCl 溶于42.7 ml 的TBS 中,4 度保存;
      8. 15% CsCl:9.085 g CsCl 溶于47.69 ml 的TBS 中,4 度保存;
      9. Beckman 离心管:14*89 mm,SW41 转头;
      10. Polybrene (sigma),10 mg/ml;
      11. 透析袋:Spectrum Co. (成卷供应,带少量甘油,硫化物与重金属),MW=8000~14400;
      12. 灭菌甘油。

三、操作流程:

1. 293 细胞(E1-transformed human embryonic kidney cells 在转染前24 小时接种于1 或2 个60 mm 培养盘中,使之在转染时细胞汇合率为50-70%;

2. 在转染前,用Pac I 处理目的质粒(一般一个60 mm 细胞盘需要6μg DNA)。处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20 μl 无菌水中;

3. 用PEI 或其他转染试剂将6 μg Pac I 处理过的质粒转染细胞;

4. 8 个小时后移去混合液,加入4 ml DMEM 完全培养液(10% CBS,1%Pen/Strep);

5. 在转染后7 到10 天用细胞刮(而不是胰酶)将细胞从瓶中刮下并移入50ml锥形管。离心后将细胞重悬于2.0 ml PBS 或全培液中。于液氮中冻结细胞,37℃水浴中溶解,剧烈振荡。此步骤共进行4 次。注意保存时不要反复冻融,可保存于-20℃;

6. 将293 细胞以50-70%的汇合率铺于60 mm 培养盘中,以30-50%的体积比加入含病毒上清液。在感染后2-3 天即可看到明显的细胞裂解或CPE 现象;

7. 在有1/3 到1/2 的细胞脱离漂浮时,通常是感染后3-5 天收集病毒。可进一步通过Western blot 或PCR(5 μl 病毒上清加上10 μl PCR-grade Protease K,55℃消化1 小时,然后煮沸样品5 min,离心后取1-2 μl 进行PCR 反应)证实重组腺病毒的存在;

8. 按步骤5 的方法收集病毒上清。在这种情况下一般至少可收集到107 infectiousparticles/ml 的病毒。每轮的扩增应能提高一个数量级的梯度;

9. 为了进一步扩增,将步骤8 获得的病毒上清进一步感染100 mm 培养盘的细胞,按步骤5 的方法收集病毒,并进而将其感染150 mm 细胞培养盘中的293细胞,以获得足够量的病毒;

10. 将15% CsCl 和40% CsCl 加入Beckman 离心管中制备CsCl 梯度溶液;

11. 将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl 梯度溶液上;

12. 超速离心,30000 rpm,4 度离心16 个小时;

13. 离心后,应有两条带。位置较高,颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳,不具感染能力;位置较低,颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用16 号针头将这一条带收集;

14. 在TBS 中透析一小时,随后在含有10%甘油的TBS 中透析两次,每次一小时;

15. 将纯化的腺病毒分装于EP 管中;

16. 在Eppendorf Biophotometer 中测量透析液中的总蛋白量,1μg 病毒蛋白相当于4×109病毒颗粒;

17. 长期保存于-70 度中,短期可保存于4 度,切忌反复冻溶;

18. 由于腺病毒对不同细胞株的感染效率存在差异,且考虑到病毒颗粒的细胞毒副作用,通常通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。以相对细胞数1:1,10:1,100:1,1000:1 的病毒颗粒感染靶细胞;加入相对培养液体积1:1000 的Polybrene。在37 度下平板离心30 分钟;

19. 感染8~12 小时后换液。将含有病毒的培养液小心移入含有消毒液的废液缸中,加入适量全培液。